非放射性高標識DNAプローブ法

従来、人々はプローブDNAを放射性同位体で標識していた。近年、非同位体標識法は急速に発展し、同位体標識法に代わる傾向がある。地上高配位子ランダム標識DNAプローブ法は、比較的成功した非同位体標識方法（Saikiなど、1985）である。その原理は：ステロイド系半抗原高分子を化学的方法でdUTP（Dig−dUTP）に接続することである。ランダムプライマー及びDNAポリメラーゼを用いて、プローブDNAをテンプレートとして、相補DNAを合成し、化学修飾されたdUTPを同時に標識DNAプローブに組み込む。ハイブリダイゼーション後に塩基性ホスファターゼで標識された抗地高単抗は標識プローブDNA中のDig−dUTPと結合し、発色基質を添加し、塩基性ホスファターゼの作用下で、濃い茶色または青色の化合物に転換した。またはX−film放射で自己現像する。地上高標識DNAの基本的なプロセスは、DNAプローブの製造、標識プローブの製造、サンプルの検出である。その中で重要なステップは高感度、高特異性のプローブを得ることである。
新たに合成されたDNA鎖に20〜25ヌクレオチドごとにDig−dUTPを組み込むことができ、反応時間は約1時間である。
ハイブリダイゼーション：標準ハイブリダイゼーション方法に従って行う。ナイロンフィルムや硝酸セルロースフィルムを用いることができる。使用済みハイブリダイゼーション液は−20℃で凍結保存し、繰り返し使用することができる。
免疫学的検査：ブロック後、反応の*段階を検査し、抗体結合物と標識DNAを結合し、ハイブリダイゼーションの半抗原−標識DNAが出現し、発色反応の開始は塩基性pH条件下で無色の発色剤X−リン酸塩とニトロランテトラゾールNBTを添加し、数分以内に青色が出現し始め、発色反応の過程は3日間続いた。典型的な例は、24時間後に発色反応を停止することである。ナイロンフィルム上の色をジメチルホルムアミドで洗い流した後、ナイロンフィルムはハイブリダイゼーションに再利用することができる。
応用：地高配位基標識DNAプローブ及び測定キットは、0.1 pgの同源DNAを測定でき、哺乳動物DAN中の1µgの単コピー遺伝子を測定でき、放射性標識システムと比較して、このキットは迅速に実験結果を得ることができ（DNAの標識とハイブリダイゼーションから測定結果を見るまで24 h以内に完成することができる）、しかも放射性の不安全問題を除去した。試薬の感度と特異性は、同位体標識および放射自己現像法の代わりに、DNA−印影転移、コロニーハイブリダイゼーション、ファージ斑ハイブリダイゼーション、およびその場ハイブリダイゼーションを含むすべてのハイブリダイゼーション技術に適用される。

実験試薬

[成分：Tris-HCl（10 mM）、EDTA（1 mM）、pH 8.0（20℃）]にはサケ精DNA（50µg/ml）が含まれている。

2.ヘキサポリヌクレオチド混合物

3.標識用混合基質：この管内に50µl、濃度のdNTP標識用混合基質、dATP（1 mL）dCTP（1 MM）、dGTP（1 MM）、dTP（0.65 mM）とDig-
dUTP（0.35mM）、pH6.5（20℃）

4.DNAポリメラーゼI大断片（標識級）：この管内に25µl、DNAポリメラーゼI大断片（Klenow）、2 U／µlがある。

5.（Dig）AP結合物：この管内には200µl、ポリクローニング羊の抗地高配位子Fab-断片、アルカリホスファターゼ750 U/mlが結合している。

6.NBTは2本あり、1本1.25 ml、70%（V/V）ジメチルホルムアミドに溶解したニトロシアノテトラゾール塩溶液（75 mg/ml）。

7.X−リン酸塩、各管0.9 ml、ジメチルホルムアミドの5−ブロモ−4−クロロ−3−インドールリン酸塩に溶解したトルイジン溶液（50 mg/ml）。

8.封止剤、2本、1本に50 gの粉剤がある。

調製する溶液：

EDTA（0.2M），pH8.0（20℃）
塩化リチウム（4 M）
70%（V/V）エタノール
三塩酸（10 mM）
EDTA（1mM），pH8.0（20℃）
10%（V/V）N−ドデシルクレアチニンナトリウム塩
10%（V/V）SDS
0.3 Mクエン酸三ナトリウム
3 M塩化ナトリウム
20×SSC
pH7.0，Tris-HCl（100mM）
塩化ナトリウム（150 mM）
pH7.5 Tris-HCl（100mM）
塩化マグネシウム₂（50mM）pH9.5（20℃）
塩化ナトリウム（100 mM）

実験手順

1.測定すべきDNA 10µlを採取し、1.0%アガロースゲル上で電気泳動を行った。

2.ゲルは臭化エチルインゴットで染色し、ゲルの周りの余分な部分を切り落とし、ゲルの隅に印をつけて写真を撮り、電気泳動結果を記録する（写真を撮る時、ゲルのそばに物差しを置く）。

3.ハイブリダイゼーション用ゴムの調製
（1）ゲルを30 mL 0.25 MHCl溶液に15分間浸漬し、DNAを脱プリンさせる。

（3）ゲルを30 mL 0.4 M NaOHに30 min浸漬し、中和させる。

4.ゲルから膜へのDNA移動のためのプラットフォームの準備
（1）未使用ナイロンフィルム1枚と厚手のろ紙3枚を転写すゴムと同じ大きさに切り、ナイロンフィルムの隅に印を付ける。
（2）もう1枚の厚手の濾紙はゲルと同じ幅に切り、長さ（約18 cm）は移送液タンクの底部に達するのに十分である。
（3）10 X SSC転移液を準備する。
（4）未使用ナイロン膜を蒸留水で濡らした後、10 X SSC転移液に浸漬する。

5.キャピラリ移送装置の取り付け
（1）長いろ紙を転写プラットフォームの上部に置き、ろ紙の両端が転写ボックスの底部に達し、サイフォンブリッジを作る。
（2）8 0 mLの転移液を転移カセット内に流し込み、濾紙を湿らせる。

（4）ジェルの四辺をラップ紙で密封する。
（5）濡れた転移膜をゲルの上部に置き、ゲルと膜の間に気泡を避ける。
（6）残りの3枚の濾紙を転写膜の上に慎重に置き、吸水紙を重ねて濾紙に掛け、ガラス板を置いて、重いものを押さえる。
（7）転送数時間または一晩（少なくとも4時間）
注意：転移液を枯らさないでください。

6.転移したDNAと膜の架橋
（1）10 X SSCを浸漬した厚いろ紙の上に膜を置き、DNAのある面を上に向けた。
（2）膜をUV架橋器（crosslinker）に置き、紫外光下で3 minを自動的に架橋する。
（3）架橋された膜を蒸留水で短時間すすぎ、空気中で乾燥する。

7.標識DNAプローブは、標準的な反応のたびに10 ng〜3 ugの線形DNAを標識することができ、より大量のDNAを標識することもできるが、すべての成分と体積はそれに応じて増加しなければならない。

（1）DNAプローブは熱変性し、10分間煮沸し、急速に氷/エタノール中に5分以上冷却し、使用を待つ。

（2）Eppendorf管（1.5 ml）を取って氷の上に置き、以下及び試薬を加える：

新鮮変性DNA 1〜3µg

dNTPマーク用混合基質2µl

無菌再蒸水を加えて19µlにする

DNAポリメラーゼI大断片（Klenow 5 U/ul）1µl

（3）37℃で少なくとも60 min保温し、20 hまでできる。

（4）5分間煮沸し、反応を停止する。

（5）15000 rpm遠心分離30 s、氷の上に置いて使用する。

8.プリハイブリダイゼーションは100 cm²膜は20〜40 mlの予備ハイブリダイゼーション溶液を用い、予備ハイブリダイゼーション時に溶液を流動状態にした。

プレハイブリダイゼーション液組成：5×SSC

0.1%（W/V）N-ドデシルクレアチニンナトリウム

0.02%（W/V）SDS

フィルムをビニール袋に入れ、プレハイブリダイゼーション液を流し込み、ガスを排除した後密封し、65℃で一晩プレハイブリダイゼーションした。

9.ハイブリダイゼーション100 cm²

ハイブリダイゼーション液組成：50%ホルムアミド（V/V）

5%（W/V）封止試薬

5×SSC

0.1（W/V）N−ドデシルクレアチニンナトリウム

0.02%（W/V）SDS

新規変性マーカーDNA（150 ng/ml）

ハイブリダイゼーション液はプレハイブリダイゼーション液の代わりになり、置換時に膜は乾燥できず、膜とビニール袋の間にハイブリダイゼーション液膜を形成することに成功した。42℃で一晩（16〜20 h）ハイブリダイゼーションした。

10.フィルム洗浄は100 cmで行う²膜は250 mlの洗浄液で計算した。

（1）室温で2×SSC/0.1%（W/V）SDS溶液ですすぎ、5 min、2回。

（2）65℃条件下で0.1×SSC/0.1%SDS溶液ですすぎ、10 min、2回。

（3）室温で2×SSC溶液で1回すすぎます。

（1）溶液の調製

缓冲液1：Tris-HCl（100mM）；

緩衝液2：0.5%（W/V）封止試薬（チューブ11）、緩衝液1中に調製する（封止試薬は急速に溶解しないので、1 h前にこの溶液を調製し、試薬を50〜70℃に溶解し、この溶液は混濁を維持する）。

缓冲液3：Tris-HCl（100mM）；塩化ナトリウム（100 mM）、MgCl2（500mM）pH9.5（20℃）

缓冲液4：Tris-HCl（10mM）；EDTA（1mM）；pH8.0（20℃）

発色溶液：新鮮に調製し、10 ml緩衝液3に、45µl NBT溶液（管9）と35µl X-リン酸塩緩衝液を添加する。

（2）発色過程

A.膜を緩衝液1中で短時間洗浄（1 min）する。

B.100 mlバッファ2で30 min保温する。

C.さらに緩衝液1で短時間洗浄した。

D.緩衝液1で希釈した抗体結合物を150 U/L（1：5000）まで、希釈後の抗体結合物は4℃で12 hしか安定しない。

F.100 ml緩衝液1で膜を洗浄し、未結合抗体結合物を15 min、2回除去した。

G.膜は緩衝液3中で2分間平衡している。

H.暗い条件下で、フィルムと10 mlの発色溶液をビニール袋に入れて密封するか、適切な箱に入れて、数分以内に色が現れ始め、一般的な発色反応は1日後にすべて完了した。色が現れると、振動や攪拌はできません。

I.要求された点またはテープが検出された場合、50 ml緩衝液4で5分間フィルムを洗浄して反応を停止することができる。

J.撮影。

説明：上記の各反応はすべて室温で行い、発色反応を除いて、振動または攪拌が必要である。

注意事項

1.DNAが効果的にマーキングされない場合の考慮

（1）フェノール／抽出及び／又はエタノールで沈殿し、DNAを再精製する。

（3）DNA変性は*ではないかもしれないが、この場合は大断片DNAに特に重要である。

2.所期の感度に到達できない場合に考慮する

（1）DNAマーカー率。

（2）標識DNAの濃度を増加させるか、ハイブリダイゼーション時間を増加させる。

（3）発色反応の時間は3日間に延長することができる。

3.発色時に背景が濃すぎる場合は、

（1）ハイブリダイゼーション溶液中の標識DNA量の低減。

（2）ハイブリダイゼーション溶液の体積を増加させ、膜を溶液中に自由に浮遊させる。

（3）いくつかのタイプのナイロンフィルムは暗い背景を生成する可能性があるので、他のタイプのナイロンフィルムを採用したり、硝酸セルロースフィルムに変更したりすることができる。

(4) 在杂交和检测过程中增加封阻试剂的浓度。