ラット初代胸大動脈平滑筋細胞専用培地

操作の要点：

細胞培養手順：

一.培地及び培養凍結保存条件の準備：

1）DMEM-H培地（NaHCO 3 1.5 g/L添加）を準備し、90%、子牛血清、10%。293 T細胞を懸濁成長させるために、実験の必要に応じて懸濁培地を選択することもできる。

2）培養条件：気相：空気、95%、二酸化炭素、5%。温度：37℃、培養箱の湿度は70%〜80%である。

3）凍結保存液：90%培地、10%DMSO、現用現用配合。液体窒素貯蔵。

二.細胞処理：

1）蘇生細胞：1 mLの細胞懸濁液を含む凍結保存管を37℃の水浴中で急速に揺動解凍し、4 mL培地を加えて均一に混合した。1000 RPM条件下で4分間遠心分離し、上澄み液を捨て、1-2 mL培地を補充した後、均等に吹き付けた。その後、すべての細胞懸濁液を一晩培養瓶に加えて培養した（または細胞懸濁液を10 cm皿に加え、約8 mlの培地を加え、一晩培養した）。翌日に液を交換し、細胞密度を検査した。

2）細胞継代：細胞密度が80〜90%に達すると、継代培養を行うことができる。

壁貼り細胞の場合、継代は以下の方法を参照することができる：

1.培養上清を廃棄し、カルシウム、マグネシウムイオンを含まないPBSで細胞を1〜2回潤洗した。

2.消化液2 ml（0.25%Trypsin-0.53 mM EDTA）を培養瓶に入れ、37℃培養箱に置いて1-2分間消化し、その後顕微鏡下で細胞消化状況を観察し、もし細胞の大部分が丸くなって脱落したら、速やかに操作台に戻し、培養瓶を数回軽くたたいた後、少量の培地を加えて消化を停止した。

3.6-8 ml/瓶で培地を補充し、軽く均等にしてから吸引し、1000 RPM条件下で4分間遠心分離し、上澄み液を捨て、1-2 mLの培養液を補充してから均等に吹き付ける。

4.細胞懸濁液を8 mlの培地を含む新しい皿または瓶に1：2〜1：5の割合で分けた。

3）細胞凍結保存：細胞成長状態が良好な場合、細胞凍結保存を行うことができる。壁貼り細胞を凍結保存する場合、培地を捨てて少量を加え、細胞が丸くなって脱落した後、血清を含む培地を約1 ml加えて凍結保存管に加え、さらに10%DMSOを添加して凍結保存を行った。

細胞を冷凍保存する方法？

冷凍保存方法1：冷凍管を4℃30 ~ 60分→（-20℃30分*）→-80℃16 ~ 18時間（または一晩おき）→液体窒素槽vaporphaseに長期保存する。

冷凍保存方法2：冷凍管を設定したプログラム可能な降温機に置き、毎分1〜3℃から–80℃以下に下げ、更に液体窒素槽vapor phaseに入れて長期保存する。-20℃は1時間を超えてはならず、氷結晶が大きすぎて細胞が大量に死ぬのを防ぐために、このステップをスキップして-80℃の冷蔵庫に直接入れることもできますが、生存率は少し低下します。