AFDye 555 NHS ester細胞染色

AFDye 555 NHS エステル

（アレクサフロール 555 NHS エステル相当）

製品情報

製品説明

AFDye 555は水溶性、強い光安定性を有する染料であり、非常に高い光量子収量を有する。AFDye 555はオレンジ色の蛍光を発する染料であり、488 nmまたは532 nmのレーザースペクトル線を用いて励起することができる。Cy 3またはテトラメチルローダミンの代替品であり、生細胞および固定細胞中の光安定性はCy 3より優れている。pH 4-10の範囲で耐性が強い。

AFDye 555 NHSester（Equivalent toAlexa Fluor 555 NHSester）は、アミン反応、オレンジ蛍光を発する染料であり、通常、タンパク質または抗体、ポリペプチド、アミン基修飾オリゴヌクレオチド、およびその他のアミン基含有生体分子を第1級アミンによって標識する。この標識は通常、pH 7〜9の範囲でzuiが有効であり、安定した共有結合アミド結合を形成する。

製品の特徴

保存と輸送方法

保存：-20ºC遮光乾燥保存、2年間有効。

輸送：氷嚢輸送。

注意事項

1）蛍光染料はいずれも消光問題があるので、蛍光消光を遅らせるためにできるだけ遮光に注意してください。

2）AFDye NHS esterシリーズ染料は一定の水溶性があるが、DMSO、DMFで溶解して母液を調製し、その後の標識実験を行うことを強く推奨する。これらの反応性基は、水溶性系において非常に加水分解されやすく、非反応性の遊離酸形態を生成するからである。

3）安全と健康のために、実験服を着て使い捨て手袋をはめて操作してください。

一、染色工程（免疫グロブリンIgGの標識を例に）

ほとんどのタンパク質またはポリペプチドはアミン反応試薬（プローブ）で標識することができる。以下はIgG抗体に対して最適化された標識工程であり、ユーザーは自己蛋白量に基づいて反応系を拡大または縮小することができるが、理想的な染色結果を得るためには、蛋白濃度は2 mg/ml未満ではならない。異なるタンパク質（ポリペプチド）に含まれるアミン基の数、アミン基の表面位置には大きな差があるため、ユーザーは最初の実験時に、zuijia標識効率を達成できるモル比をスクリーニングするために、3組の異なるアミン反応試薬：タンパク質のモル比を確立することを提案する。

1.1 1 ml 0.1 M炭suan水素ナトリウム緩衝液にタンパク質10 mgを十分に溶解する。

注①：タンパク質濃度は通常5〜20 mg／mlであり、カップリングの成功率はタンパク質濃度に高度な依存性を有する。濃度が2 mg/ml未満であると、標識効率に深刻な影響を与える。

注②：標識系は、Tris、glycine、アンモニウム塩、またはBSAなどの他の安定タンパク質、例えば標識されるタンパク質溶液に上記物質が含まれる汚染を避けるために、10-20 mMのリン酸塩緩衝液（PBS）に透析し、さらにタンパク質溶液1 mlに1 M重炭酸塩緩衝液（pH 8.3-9.0）0.1 mlを加えて必要なpH値に調整する必要がある。

注③：抗体溶液中に存在する低濃度アジドナトリウム（＜3 mM）または硫黄水銀散布（＜1 mM）は標識反応を妨害しない。

1.2アミン反応試薬（プローブ）（例えば：AFDye 555 NHSester）を高品質無水DMFまたはDMSOで10 mg/mlに溶解する。

注①：AFDye 488 NHS esterの水溶液は必ず現用し、保存できない。水溶液中にあるため、不活性遊離酸に加水分解される。AFDye 488 NHS esterのDMSO貯蔵液は≦−20℃で保存でき、2週間以内に使い切ることを提案する。

1.3アミン反応試薬（プローブ）50〜100µlを撹拌またはスクロール蛋白質溶液をゆっくり添加する。

注①：アミン反応試薬（プローブ）を添加する量は0.5-1 mgであり、全体的には、約1/4-1/3のアミン反応試薬が蛋白質に結合する。タンパク質や標識試薬によって標識効果が異なりますので、状況に応じて両者の割合を最適化してください。

1.4室温で1時間（またはそれ以上）ゆっくり撹拌して光を避けてインキュベートする。

1.5【オプション】新鮮に調製した1.5 Mヒドロキシルアミン（pH 8.5）0.1 mlを加えることにより反応を停止し、室温でヒドロキシルアミン含有系を1 hインキュベートした。

1.6精製：標識生成物を精製し、塩イオンまたは未反応のアミン反応試薬を除去するための透析法、P−30カラムまたはPD−10カラムなどの適切な方法を選択する。

1.7保存：標識されたタンパク質は2〜8℃で光を避けて保存する。精製されたタンパク質カップリング濃度＜1 mg/mlの場合、BSAまたは他の安定タンパク質1〜10 mg/mlを添加する。2 mMアジドナトリウムが存在する場合、2〜8℃で数ヶ月保存することができる。より長い時間保存する必要がある場合は、分装後-20℃で光を避けて保存し、繰り返し凍結融解を避ける必要がある。

二、タグ比率（F/P値）を計算する

免疫グロブリンIgGなどのほとんどの抗体にとって、モル吸光係数は203000であり、F/P値は4〜9の間が最適である。
2.1 AFDye 555マーカータンパク質F/P値の計算：
1）定量された少量の精製されたカップリングタンパク質をPBS精確倍数で希釈し、1 cm比色皿中で280 nmと555 nmの光吸収を測定する、
2）試料中の蛋白質濃度を計算する：蛋白質モル濃度=（A 280-（A 555×0.08）×希釈倍数/203,000
3）標識比率の計算：タンパク質結合1モル当たりの染料モル数＝A 555×希釈倍数／（150000×タンパク質モル濃度）

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——Written/Edited by V.Shallan【著作権はMKBio愚康の所有】

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