農桿菌の電気転移感受性細胞のクローニングと発現分析

EHA105（pSoup）電気有能セル

アグロバクテリウム電気転移受容体細胞

製品ラベル：

EHA 105菌株、アグロバクテリウム受容体細胞、Rifampicin（Rif）利fu平、Kanamycin（カン）カナメイシン、EHA101；LBA4404；GV3101；AGL1；植物遺伝子組み換え研究

製品の注文：より大きな包装や製品技術的な問題、

製品の説明：

EHA 105菌株はEHA 101菌株から改造され、染色体背景はC 58であり、核遺伝子はスクリーニングラベル−リフ平抵抗性遺伝子rifを含み、転化操作を容易にするため、この菌株は自己転移機能のないコハク塩基型TiプラスミドpEHA 105（pTiBo 542 DT−DNA）を持ち、このプラスミドはvir遺伝子（vir遺伝子はT−DNAが植物ゲノムに挿入するために必要な要素であり、pEHA 105（pTiBo 542 DT−DNA）プラスミド自身のT−DNA転移機能は破壊されたが、転入したバイナリベクターT−DNAの円滑な転移を助けることができる）を含む。EHA 105菌株にhelpプラスミド：pSoupを転入すると、EHA 105（pSoup）菌株が得られ、pGreen、62 SK、pGs 2シリーズプラスミドの農桿菌中での複製を助けることができ、同時にこの菌株にテトラサイクリン（tetR）耐性を与え、水稲、タバコなどの植物の遺伝子組み換え操作に適している。

我が社（トラカン生物）が提供するEHA 105（pSoup）電気転移感受性細胞は特殊な技術を経て作製され、特に大プラスミドの転化に適している。遺伝子型はC 58（rifR）Ti pEHA 105（pSoup）（pTiBo 542 DT-DNA）Succinamopine（pSoup-tetR）であり、pGs 2プラスミドにより変換効率>105 cfu/μg DNAを検出した。

製品構成要素：

保存と輸送条件：

保存：-80℃保存、1年間有効。

輸送：ドライアイス輸送。

注意事項

1）感受性細胞は−80℃に保存すべきであり、感受性細胞の転化効率を低下させないように、繰り返し凍結融解と放置時間が長すぎてはならない。

2）全体の転化操作は、厳格に相応の温度及び無菌条件の要求に基づいて行う。

3）プラスミドを添加する体積は、受容状態体積の1／10を超えてはならない。プラスミドが不純であるか、エタノールなどの有機物汚染が存在すると、転化効率が急激に低下する。プラスミドは2倍に増加し、転化効率は1桁低下した。

4）zuiの高い転化効率を確保するために、全体の操作過程はできるだけ柔らかくし、低温を維持しなければならない。

5）高濃度のプラスミドを変換することにより、最終塗布プレートの使用量を減少させることができる。

6）平板上のクローン密度が大きすぎる場合、栄養不足のため、クローン成長が遅くなり、コロニーが小さくなる。大きなコロニーを得るためには、プラスミドの使用量を減らすべきである。

7）培地にリフルピンを添加する目的は雑菌の成長を防止し、農桿菌をスクリーニングすることである、使用した菌株の耐性に基づいてストレプトマイシンまたは慶大マイシンを添加するとTiプラスミドの紛失を防止することができるが、ストレプトマイシンは農桿菌の遺伝子組み換え操作に不利であり、一般的に農桿菌を培養する際にストレプトマイシンまたは慶大マイシンを考慮しない、Tiプラスミドの紛失の確率は極めて低いため（基本的には無視できる）

8）安全と健康のために、実験服を着て使い捨て手袋をはめて操作してください。

使用方法

1）0.1 cm電撃カップとカップ蓋を貯蔵液から取り出してきれいな吸水紙の上に5 min逆さまに置き、水気を切り、5 min正置し、エタノールを十分に揮発させてきれいにし、直ちに氷の中に挿入し、氷を固め、電極カップは氷面から0.5 cm離れてカップ蓋を閉めやすくし、氷の中に5 min静置して十分に温度を下げる。

2）−80℃で保存した受容体細胞を氷に5分間挿入し、溶解させた。

3）50μlの受容体細胞懸濁液に0.01 ~ 1μg（体積6μl以下）のプラスミドDNAを添加し、管底を手boで叩いて均一にし、直ちに氷に挿入した。銃で感受性細胞-プラスミドを軽く吹き込んで混合した後、急速に電撃カップに移し、カップの蓋をして、空管は保留している【注意：感受性状態の転化効率が高いため、diは一度にzuihaoを用いて予備試験を行い、zuijiaのプラスミド使用量を確定する】。

4）電気回転器を起動し、パラメータを設定する：C=25μF、PC=200 ohm、V=2400 V（このパラメータはBio-radを参照し、具体的な使用は電気回転器の推薦ステップを参照して操作してください）、電気回転槽に電気ショックカップを急速に入れ、電気ショックは急速に氷の中に挿入することを完成する。

5）700μlの抗生物質フリーLBを添加し、28℃で2〜3 h振動培養した受容空管に移した。

6）6000 rpmで1 min遠心分離し、約100 ulの上清を留取し、その後銃で重懸濁菌体を軽く吹き付けた。その後、対応する抗生物質を含むLBまたはYEBプレートに加え、細胞を無菌ガラス棒で軽く均一にコーティングした。室温で10分間正置し、液体が吸収された後、平板を逆さにし、28℃で2〜3日間培養した。【注意：平板が転化に用いられる二元担体抗生物質のみを含む場合、28℃で48 h培養すればよい、平板に二元担体抗生物質を添加すると同時に、10μg/mlのリフを添加すると、28℃で48 ~ 60時間培養する必要がある、平板に二元担体抗生物質を添加すると同時に、20μg/mlのリフを添加すると、28℃で60 ~ 72時間培養する必要がある、20μg/mlを超えるリフを平板または液体培養に使用することを提案しない。

7）目的クローンの液体培養：

j小量揺菌：15 mlの円底通気試験管に対応抗生物質を含むLB液体培地を1 ml加え、新鮮培養した平板から1-2個の単コロニーを選んで接種し、30℃、200 rpm揺菌24-48 h。

k大量の菌振り：100 ml通気三角瓶内に20 ml未満の対応抗生物質を含むLB液体培地を添加し、小菌振り液を取って2%の割合で菌を接合し、30℃、200 rpm菌振り24-48 h。

【注意】：アグロバクテリウム（好酸素菌）にとって、固体平板でも液体揺菌でも大量の酸素が必要である。液体菌振り成功の鍵は培地に十分な溶存酸素が含まれることを保証することであり、j用通気試験管または三角ボトル、k栄養液に大きな断面と小さな厚さがあることを確保する、l抗生物質はできるだけ少ないか、添加しなければならない抗生物質はできるだけ低濃度を使用する。

関連製品【受容体細胞シリーズ】

別表1固体及び液体LB培地処方

別表2固体及び液体YEB培地処方

別表3よく見られるアグロバクテリウム対抗生物質感受性総表

——Written/Edited by V.Shallan【著作権はMKBio愚康の所有】

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