FITC-Annexin V/PIアポトーシスキット

FITC-Annexin V/PIアポトーシスキット

製品番号：F6012L型

製品仕様：100T

保管条件：

4℃光を避けて冷蔵してください。凍結保存しないでください。有効期限は外装を参照。

スペクトル特性：

FITC-アネクシンV: Ex/Em = 494/518 nm

PI: Ex/Em = 535/617 nm（DNAを含む）

製品紹介：

FITC-アネクシンV/PIアポトーシスキットは、早期アポトーシス細胞（緑色）および壊死または晩期アポトーシス細胞を標識することにより迅速で簡便な方法を提供する（赤）細胞アポトーシスレベルを検出する。製品は、フローサイトメータまたは他の蛍光検出装置を用いて検出することができる。

アネクシン V（メンブレンタンパク質－V）は分子量が35-36KDのカ2+依存性リン脂質結合蛋白質は、リン脂質アシル（PS）選択的結合。ホスファチジニル（PS）主に細胞膜の内側、すなわち細胞漿に隣接する側に分布する。細胞のアポトーシス発生の早期には、異なるタイプの細胞がリン脂質をアシルは細胞表面に外反転し、細胞外環境に暴露される。この場合、緑色蛍光プローブを用いるFITCマークアネクシン V、すなわちFITC - アネクシンV，外反転ホスファチジニル（PS）を結合することにより、ホスファチジルの外反転という細胞アポトーシスをフローサイトメータまたは蛍光顕微鏡で直接検出することができる重要な特徴徴集する。壊死または末期アポトーシスした細胞については、細胞完全性が破壊されているため、FITC - アネクシンV細胞質スラリーとリン脂質層の内側にあるPS結合することにより、壊死細胞も緑色蛍光を呈する。

ヨウ化ピリジン（ヨウ酸プロピウム、PI)は、DNA壊死細胞やアポトーシス末期に細胞膜の完全性を失った細胞の細さを染色することができる結合染料細胞核PIは、488、532 または546nmのレーザー励起により、赤色蛍光を呈する。

使用方法：

1.実験設計：

ブランク管：陰性対照群細胞、無添加FITC-アネクシンV/PI。電圧調整用。

単染管：陽性対照群細胞、添加のみFITC-アネクシンV/追加のみPI。補償の調整に使用します。

検査管：処理した細胞、加FITC-アネクシンV/PI。ブランク管と単染管で電圧補償を調整した後、必要なフローデータを得る。

2.収集細胞：

（1）懸濁細胞について：

a。アポトーシス刺激を行った後、1000回転分遠心分離5分、上清を捨て、細胞を集め、PBS細胞を軽く再懸濁して計数する。注：PBS重懸濁は省略できませんが、PBS再懸濁の過程は同時に細胞を洗浄する役割も果たし、後続を保証することができるFITC-アネクシンVと結合します。

b。取5×104 -1×105重懸濁した細胞が1000回転分遠心分離5分、清朝を捨てて、加入する100 µL 1×アネクシンV結合緩衝液は細胞を軽く再懸濁する。

c。加入5 µL FITC-アネクシンV、軽く混ぜる。

d。加入5 µLのPI染色液、軽く混ぜる。

e。室温（20-25ºC）遮光培養10〜15分。アルミニウム箔を使用して遮光することができます。インキュベーション中に細胞を再懸濁することができる2-3を使用して染色効果を改善します。

（2）壁貼り細胞について：

a。細胞培養液を適切な遠心管内に吸引、PBS壁細胞を1回洗浄し、適量の細胞消化液を加える(不含EDTA）消化細胞室温で軽く吹きつけるまでインキュベートすることで、壁細胞を吹き下ろすことができる場合、細胞消化液を吸引除去する。避けたい過消化。注：壁貼り細胞には消化手順が重要である。消化時間が短すぎると、細胞は強く吹いて脱落する必要があり、細胞膜の損傷をもたらしやすく、それによって細胞壊死の偽陽性を引き起こす、消化時間が長すぎると、同様に細胞膜損傷を引き起こしやすく、細胞壊死の偽陽性が現れ、細胞膜上のホスホニルとFITC-アネクシンVの結合により、細胞アポトーシスの検出を妨害する。

b。前段階で集めた細胞培養液を加え、細胞を軽く吹き落として遠心管内に移し、1000回転分遠心分離5分、上清を捨て、細胞を集め、PBS細胞を軽く再懸濁して計数する。注：前段階の細胞培養液を加えることは非常に重要であり、一方では懸濁したアポトーシスまたは壊死が発生した細胞を収集することができ、他方では細胞培養液中の血清は有効に残留を抑制または中和することができる。残ったものは消化され分解されてから添加されるFITC-アネクシンVを選択し、染色に失敗しました。

c。取5×104 -1×105重懸濁した細胞が1000回転分遠心分離5分、清朝を捨てて、加入する100 µL 1×アネクシンV結合緩衝液は細胞を軽く再懸濁する。

d。加入5 µL FITC-アネクシンV、軽く混ぜる。

e。加入5 µLのPI染色液、軽く混ぜる。

f。室温（20-25ºC）遮光培養10〜15分。アルミニウム箔を使用して遮光することができます。インキュベーション中に細胞を再懸濁することができる2-3を使用して染色効果を改善します。

3.結果分析：

（1）フローサイトメータ測定：

a.インキュベーションが完了した後、400μL 1×Annexin V結合緩衝液再懸濁細胞を直接添加し、直ちに機械的に測定することができ、FITC-Annexin Vは488 nmレーザーにより励起され、蛍光発光スペクトルは530 nm（FITCチャネル）、PIチャネル発光スペクトルは約617 nmにあることを測定する。

b.二変数フローサイトメータの散点図において、左下象限は生細胞を示し、（FITC-Annexin V-/PI-）、右下象限は早期アポトーシス細胞であり、（FITCAnnexin V+/PI-）、右上象限は壊死と晩期アポトーシス細胞であり、（FITC-Annexin V+/PI+）、左上象限は裸核細胞を示し、（FITC-Annexin V-/PI+）である。

（2）蛍光顕微鏡検査：

a.1000 rpmで5分間遠心分離し、細胞を収集し、400µL 1×Annexin V結合緩衝液を用いて細胞を軽く再懸濁した。細胞を96ウェルプレートに移してしばらく沈降させるか、細胞コーティングを行った後、蛍光顕微鏡下で観察した。

b.FITC−Annexin VはFITC適用フィルタ、PIはCy 3またはTexas適用フィルタを使用することができる。

注意事項：

1. 使用前に製品を瞬時に管底まで遠心分離し、その後の実験を行ってください。

2. 細胞アポトーシスプロセスを低減するために、インキュベーションプロセスは氷の上で操作することができるが、インキュベーション時間は少なくとも30分。

3. アポトーシスは迅速なプロセスであるため、サンプルは染色後に1時間解析を行います。

4. 壁細胞に対して、消化は重要なステップである。壁貼り細胞がアポトーシスを誘導する際に浮遊細胞があれば、浮遊細胞と壁貼り細胞を収集した後、合成染色しなければならない。壁貼り細胞を処理する際は注意して操作し、人為的な損傷細胞をできるだけ避けるようにしなければならない。消化時間が短すぎて、細胞は強く吹きつけてから脱落する必要があり、細胞膜の損傷をもたらしやすく、PI摂りすぎ消化時間が長すぎると、細胞膜は同様に損傷を与えやすく、細胞膜上のホスファチジルとFITC-アネクシンVの結び目です。消化時に孔板底を敷き詰めた後、軽く揺らす時に細胞と十分に接触し、それから大部分を捨て、残りの少量を利用して再びしばらく消化し、細胞間の隙間が増大するのを待って、瓶底は花斑状で終わる。消化液にはできるだけ使わないEDTA，EDTA影響を与えるアネクシン VとPSと結合します。

5. 壁貼り細胞用消化後、培養条件と培地で約30分後染色し、偽陽性を避ける。

6. 細胞を洗浄する際に細胞が失われるのを避けるために、吸液時に大きなヒントヘッドセットに小さなヒント頭吸液

7. 染料の使用濃度は具体的な実験要求によって決定される。

8. 蛍光染料はいずれも急冷問題があるので、保存と使用中はできるだけ遮光に注意して、蛍光急冷を遅らせてください。

9. 安全と健康のために、実験服を着て使い捨て手袋をはめて操作してください。