ヒト脳線維芽細胞

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ヒト脳線維形成は脳組織から分離し、大脳は左右2つの半球に分かれており、大脳皮質（灰質）は各大脳半球の大部分を覆っており、ニューロン細胞体が集中している場所である。内部は神経繊維や髄鞘からなる白質である。各半球には3つの面、すなわち外側面（皮質面積全体の約1/3）、内側面と底面（2/3の面積を占める）、半球の表面には深浅不等の溝や裂け目、溝や裂け目の間の隆起がたくさんあり、それらは大脳の表面積を大幅に増加させた、大脳外側面の重要な溝、裂け目には大脳外側裂け目、天枕裂け目、中央溝がある。三溝裂の境界が隔てられているため、大脳皮質成分は前頭葉、頂葉、側頭葉、枕葉の4つの大部分に分けられる。線維芽細胞（Fibroblast）は疎結合組織の主要細胞成分であり、胚胎時期の間葉芽細胞から分化した、線維芽細胞は大きく、輪郭がはっきりしており、突起の紡錘形や星形の扁平状構造が多く、その細胞核は規則的な卵円形を呈し、核仁は大きくて明らかである。線維芽細胞は機能活動が旺盛で、細胞質は弱アルカリ性を好み、明らかな蛋白質合成と分泌活動を備え、一定の条件下で、それは線維細胞との相互転化を実現することができる、線維芽細胞は異なる程度の細胞変性、壊死、組織欠損の修復に非常に重要な役割を果たしている。分離したばかりの脳線維芽細胞は円形で屈折性が良く、培地に懸濁している。30 min細胞は壁に貼り、その中の部分は偽足を伸ばし始め、小さな突起として現れた、6 h後の細胞は基本的に壁wanを貼り、紡錘形に伸び、細胞核ははっきりしており、分布は比較的に均一で、散在して成長し、凝集せずに塊になる;細胞の成長は迅速で、5-7日で融合状態を呈し、細胞の配列は緊密で、あるものは交差して重なり合って成長し、平坦で、細胞体は大きく、細胞質は透明で、細胞核は大きく、楕円形で、色は薄い。細胞が融合し、互いに網目状に結合する、細胞は突起の紡錘形または星形の扁平分布を呈している。
メソッドの概要：

会社の実験室で分離されたヒト脳線維形成用yiプロテアーゼ−コラーゲン混合消化法は差速壁貼り法と結合して製造され、細胞総量は約5×10？cells/瓶。
品質検査：

会社の実験室で分離されたヒト脳線維形成経Vimentin免疫蛍光鑑定により、純度は90%以上に達することができ、しかもHIV-1、HBV、HCV、マイコプラズマ、細菌、酵母と真菌などを含まない。

培地 含むFBS、成長添加剤、ペニシリン、Streptomycin等

液交換周波数 毎2-3日に1回液交換

せいちょうとくせい 壁を張る

細胞形態 線維芽細胞様

世代プロパティ 伝達可能5世代程度3世代以内の状態

しょうかえき 0.25%yiプロテアーゼ

培養条件 気相：空気、95%；CO2の5％

準備作業

1.実験器材の準備：無菌の培養皿、培養瓶、ピペット、遠心管、手術器械などを準備し、高圧滅菌またはその他の適切な消毒処理を行う。

2.試薬の準備：適切な培地、消化酵素（例えば、コラーゲンなど）、ウシ胎児血清、双抗などの試薬を調製または購入し、無菌で有効期間内であることを確保する。

3.実験動物または組織由来の準備：実験ニーズに応じて、適切な動物を選択し、相応の麻酔または処刑を行い、必要な組織を獲得する、または既存の組織サンプルライブラリから組織を取得します。

取材と処理

1.取材：無菌条件下で、迅速に目標組織を取り出し、できるだけ組織への損傷を減らし、そして余分な脂肪、結合組織などの非目的組織を除去する。

2.洗浄：取り出した組織を予冷無菌PBSで数回洗浄し、血液と不純物を除去した。

3.切り取り：組織を約1-2 mm³の小さな塊に切り取り、その後消化する。

細胞分離

1.消化：切った組織塊を適量の消化酵素を含む遠心管に入れ、37℃の恒温ロッカまたは培養箱で一定時間消化する。その間に遠心管を軽く揺らして消化を均一にすることができます。

2.消化停止：組織塊の大部分が単細胞懸濁液または小細胞塊に消化された場合、血清含有培地を添加して消化を停止する。

3.濾過と遠心分離：細胞篩で細胞懸濁液を濾過し、未消化組織破片を除去し、その後濾液を適切な回転速度で遠心分離し、細胞沈殿を収集する。

細胞観察と検出

1.日常観察：毎日倒置顕微鏡で細胞の形態、成長状態、密度などを観察し、細胞の変化状況を記録し、例えば細胞汚染や異常を発見し、直ちに相応の措置をとる。
2.細胞計数と活力検査：必要な場合、台望藍染色などの方法を用いて細胞を計数と活力検査を行い、細胞の成長状況と健康状態を知ることができる。

一、取材と分離

1.迅速な操作

−室温または非栄養環境への長時間曝露を回避するために、組織の取材後すぐに処理する必要がある。

−無菌PBSまたは生理食塩水を用いて組織を洗浄し、血液、不純物を除去する。

2.消化酵素の選択

−組織タイプに応じて消化酵素を選択し、過剰消化による細胞損傷を回避する。

−消化時間は、細胞解離状態を顕微鏡により観察することができる厳格な制御（通常10〜30分）が必要である。

二、培養条件の最適化

1.培地の選択

・血清または特定の成長因子を含む培地（DMEM、RPMI 1640など）を使用して、一部の細胞にインスリン、EGFなどを添加する必要がある。

・培地ブランドまたはバッチの頻繁な交換を回避し、細胞適応圧力を減少させる。

2.壁貼りと継代

・初代細胞の壁貼り能力が弱く、シャーレ（コラーゲン、ポリウレタンなど）を包含する必要がある場合がある。

・継代時密度は70〜80%に制御することが推奨され、過度の合流は接触抑制と分化をもたらす。

三、汚染制御

1.無菌操作

-全過程を超浄台で操作し、交差汚染を回避するために使い捨て消耗品を使用する。

−培地に二重抗を添加することができるが、長期使用は細胞活性に影響を与える可能性がある。

2.マイコプラズマ検出

・定期的にマイコプラズマ汚染（例えばPCR法）を検査し、汚染後直ちに細胞を廃棄する必要がある。

四、状態監視

1.日常観察

・細胞形態、密度及び培地の色を毎日検査し、培地を適時に交換する（通常2〜3日ごとに液交換する）。

-細胞が丸くなり、破片が増えるなどの異常な形態は、汚染や栄養不足を示唆する可能性がある。

2.継代と凍結保存

・初代細胞分裂回数は限られており（一般的に5〜10代）、早期代次細胞を速やかに凍結保存する必要がある。

-凍結保存液はDMSO+血清（または専用凍結保存培地）を使用し、勾配が低下した後に液体窒素を保存することを提案する。