マウス肝炎ウイルスプローブ法による蛍光定量RT−PCRキット細胞株類

【製品名】マウス肝炎ウイルスプローブ法による蛍光定量 RT-PCRキット

名前：マウス肝炎ウイルス(MHV)プロベグRT-PCRKit

【包装規格】50回/箱

【想定される用途】マウス肝炎ウイルス（MouseHepatitisVirus、MHV）はRNAウイルスであり、ウイルスは血液と内臓、特に肝臓と腎臓に存在し、糞尿にも見られ、マウスに対して高度な伝染性があり、マウス肝炎はMHVによる1種の伝染病であり、毒を持つマウスは分布しているが、正常な状況では不顕性感染を呈することが多く、ストレス要因の励起下でのみ致死性疾患となり、主に肝炎と脳炎であるため、マウス肝炎ウイルスの迅速かつ正確な鑑定はこの病気の予防と検疫に重要な役割を果たしている。本製品はプローブ法蛍光定量RT-PCR技術を基礎として開発されたマウス肝炎ウイルスを専門に検出するキットであり、それは以下の特徴を持っている：

1.ユーザーはサンプルRNAテンプレートを提供する必要があります。

2.プライマーとプローブは最適化され、感度が高い。

3.偽陰性サンプルの区別を容易にするために、陽性対照を提供する。

4.特異性が高く、プライマーはマウス肝炎ウイルスの高度保存領域に基づいて設計され、他のウイルスのRNAと交差反応しない。

5.本製品は20μL系のプローブ法蛍光定量RT−PCR反応を50回で十分である。

6.本製品は科学研究にしか使用できない。

【規格及び成分】

【輸送及び保存】低温輸送、−20℃で保存し、保存期間は12ヶ月である。

【じこしやく】サンプル RNA。

マウス肝炎ウイルスプローブ法蛍光定量RT−PCRキット【使用方法】一、希釈標準曲線サンプル （10 E 2-10 E 6コピー/μLの6つの10倍希釈度を例に）標準品濃度が非常に高いため、以下の希釈操作は必ず独立した領域で行い、サンプルや本キットの他の成分を汚染してはならない。製品の安定性を高め、拡散伝染性病原を回避するために、本製品は生体サンプルを陽性対照として提供せず、無伝染性DNA断片のみを陽性対照として提供する。

1.6個の遠心管を標識し、それぞれ6、5、4、3、2、1である。

2.コア付きガンヘッドに45μL蛍光PCR専用テンプレート希釈液をそれぞれ添加する（好ましくはコア付きガンヘッド、以下同じ）。

3.6番管に5μL 1×10 E 7コピー/μLの陽性対照（キット提供）を添加し、十分に1分間振動させ、1×10 E 6コピー/μLの標準曲線サンプルを得た。氷の上に置いて使う。

4.ガンヘッドを交換し、5号管に5μL 1×10 E 6コピー/μLの陽性対照（前段階希釈で得られた）を添加し、十分に1分間振動させ、1×10 E 5コピー/μLの標準曲線サンプルを得た。氷の上に置いて使う。

5.ガンヘッドを交換し、4番管に5μL 1×10 E 5コピー/μLの陽性対照（前段階希釈で得られた）を加え、十分に1分間振動させ、1×10 E 4コピー/μLの標準曲線サンプルを得た。氷の上に置いて使う。

6.6つの希釈度の標準曲線サンプルが得られるまで、上記の操作を繰り返した。氷の上に置く。

二、サンプル RNA のの調製

7 .N個のサンプルがある場合は、N+2個の抽出を設定することが好ましく、複数の1つはPC（サンプル調製陽性対照）、1つはNC（サンプル調製陰性対照）である。10μL陽性対照の10000倍希釈液に一定量の水を加えて全体積を毎回の調製に必要な体積と同じにしてPCとすることができる。またNCとして水を用いた。

8 .試料のRNAを自選方法で精製し、本キットは市場のほとんどのウイルスRNA抽出キットと互換性がある。

三ProbeqRT−PCR反応(20μL系、サンプル調製室で行う)

9 .定量分析を行い、1回だけ繰り返した場合、N+9個のPCR管を標識し、そのうちN+2個は前段階で得られたN+2個のサンプルに用いられ、1個はPCR陰性対照（水でテンプレートを作る）に用いられ、6個は標準曲線に用いられる。定性分析を行い、1回だけ繰り返した場合、N+4個のPCR管を標識し、そのうちN+2個は前段階で得られたN+2個のサンプルに用いられ、1個はPCR陰性対照に用いられ（水でテンプレートを作る）、1個はPCR陽性対照に用いられる（第4号管中の陽性対照希釈液でテンプレートを作る）。以下では定量分析のみを用いて操作手順を説明する、

10 .標識管に以下の表に各成分を添加する（本表は1回の繰り返しのみを列挙する。サンプル管と陰性対照の設置が終わってから陽性対照を設置し、陽性対照サンプルはすべての管に蓋をして保存してから最後に加える）

11.ふたをしてから機械に乗り、次のパラメータで行いますqRT-PCR：

4：データ処理

12.本キットを定量検査に使用する場合、陽性対照濃度のlog値を横軸とし、Ct値を縦軸として、標準曲線を描画する。測定するサンプルのCt値を用いて標準曲線からサンプルRNA濃度のlog値を推定し、その濃度を推定した。

13 .本キットを定性検査に用い、陽性または陰性のみを判断する場合、陰性対照Ctは40以上でなければならない。陽性対照には蛍光対数成長が必要であり、典型的な増幅曲線があり、Ct値は30以下でなければならない。測定サンプルでは、Ctが40以上であれば陰性、35以下であれば陽性であった。35～40の間であれば、1回繰り返します。反復実験のCt値は40以上であれば陰性、35未満であれば陽性であった。