ヒト肺微小血管内皮細胞

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ヒト肺微小血管内皮は肺組織から分離し、肺は機体の呼吸器官で、胸腔に位置し、左右1つずつ、心の上に覆われている。肺には分葉、左二右三、計五葉がある。肺経肺系（気管支、気管支などを指す）は喉、鼻とつながっているので、喉を肺のポータルと呼び、鼻を肺以外のコツと呼ぶ。微小血管内皮細胞は再生、発育、創傷癒合など一連の生理及び炎症反応に密接に関与している。細胞は糸状または多角形を呈し、単層を形成した後に玉石様または舗装石様の配列を呈した。肺微小血管内皮細胞は半選択性障壁を構成し、この障壁は肺ガス交換に対して、血液と肺間質の間の液体と可溶物の流動を調節することが重要な意義を持っている。

メソッドの概要：

実験室で分離されたヒト肺微小血管内皮は組織パッチ法を用い、内皮細胞専用培地培養スクリーニングと結合して調製され、細胞総量は約5×10エルビウムcells/瓶であった。

品質検査：

実験室で分離されたヒト肺微小血管内皮はCD 31免疫蛍光により鑑定され、純度は90%以上に達することができ、しかもHIV-1、HBV、HCV、マイコプラズマ、細菌、酵母と真菌などを含まない。

パッケージ被条件PLL（0.1 mg/ml）またはゼラチン（0.1%）

培地FBS、成長添加剤、Penicillin、Streptomycinなどを含む

液交換周波数2-3日ごとに液交換

せいちょうとくせい壁を張る

細胞形態内皮細胞様

世代プロパティ転送可能2～3世代

しょうかえき0.25%

準備作業

1.実験器材の準備：無菌の培養皿、培養瓶、ピペット、遠心管、手術器械などを準備し、高圧滅菌またはその他の適切な消毒処理を行う。

2.試薬の準備：適切な培地、消化酵素（例えば、コラーゲンなど）、ウシ胎児血清、双抗などの試薬を調製または購入し、無菌で有効期間内であることを確保する。

3.実験動物または組織由来の準備：実験ニーズに応じて、適切な動物を選択し、相応の麻酔または処刑を行い、必要な組織を獲得する、または既存の組織サンプルライブラリから組織を取得します。

取材と処理

1.取材：無菌条件下で、迅速に目標組織を取り出し、できるだけ組織への損傷を減らし、そして余分な脂肪、結合組織などの非目的組織を除去する。

2.洗浄：取り出した組織を予冷無菌PBSで数回洗浄し、血液と不純物を除去した。

3.切り取り：組織を約1-2 mm³の小さな塊に切り取り、その後消化する。

細胞分離

1.消化：切った組織塊を適量の消化酵素を含む遠心管に入れ、37℃の恒温ロッカまたは培養箱で一定時間消化する。その間に遠心管を軽く揺らして消化を均一にすることができます。

2.消化停止：組織塊の大部分が単細胞懸濁液または小細胞塊に消化された場合、血清含有培地を添加して消化を停止する。

3.濾過と遠心分離：細胞篩で細胞懸濁液を濾過し、未消化組織破片を除去し、その後濾液を適切な回転速度で遠心分離し、細胞沈殿を収集する。

細胞観察と検出

1.日常観察：毎日倒置顕微鏡で細胞の形態、成長状態、密度などを観察し、細胞の変化状況を記録し、例えば細胞汚染や異常を発見し、直ちに相応の措置をとる。
2.細胞計数と活力検査：必要な場合、台望藍染色などの方法を用いて細胞を計数と活力検査を行い、細胞の成長状況と健康状態を知ることができる。

一、取材と分離

1.迅速な操作

−室温または非栄養環境への長時間曝露を回避するために、組織の取材後すぐに処理する必要がある。

−無菌PBSまたは生理食塩水を用いて組織を洗浄し、血液、不純物を除去する。

2.消化酵素の選択

−組織タイプに応じて消化酵素を選択し、過剰消化による細胞損傷を回避する。

−消化時間は、細胞解離状態を顕微鏡により観察することができる厳格な制御（通常10〜30分）が必要である。

二、培養条件の最適化

1.培地の選択

・血清または特定の成長因子を含む培地（DMEM、RPMI 1640など）を使用して、一部の細胞にインスリン、EGFなどを添加する必要がある。

・培地ブランドまたはバッチの頻繁な交換を回避し、細胞適応圧力を減少させる。

2.壁貼りと継代

・初代細胞の壁貼り能力が弱く、シャーレ（コラーゲン、ポリウレタンなど）を包含する必要がある場合がある。

・継代時密度は70〜80%に制御することが推奨され、過度の合流は接触抑制と分化をもたらす。

三、汚染制御

1.無菌操作

-全過程を超浄台で操作し、交差汚染を回避するために使い捨て消耗品を使用する。

−培地に二重抗を添加することができるが、長期使用は細胞活性に影響を与える可能性がある。

2.マイコプラズマ検出

・定期的にマイコプラズマ汚染（例えばPCR法）を検査し、汚染後直ちに細胞を廃棄する必要がある。

四、状態監視

1.日常観察

・細胞形態、密度及び培地の色を毎日検査し、培地を適時に交換する（通常2〜3日ごとに液交換する）。

-細胞が丸くなり、破片が増えるなどの異常な形態は、汚染や栄養不足を示唆する可能性がある。

2.継代と凍結保存

・初代細胞分裂回数は限られており（一般的に5〜10代）、早期代次細胞を速やかに凍結保存する必要がある。

-凍結保存液はDMSO+血清（または専用凍結保存培地）を使用し、勾配が低下した後に液体窒素を保存することを提案する。