ヒト網膜微小血管内皮細胞

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ヒト網膜微小血管内皮分離自己網膜組織、網膜は眼球壁の内層にあり、透明な膜である。網膜は色素上皮層と網膜感覚層からなり、2層間は病理下で分離でき、網膜離脱と呼ばれる。色素上皮層は脈絡膜と密接につながっており、色素上皮細胞から構成されており、それらは光受容器細胞の支持と栄養、遮光、放熱及び再生と修復などの作用を持っている。組織学的に網膜は10層、外向内からそれぞれ：色素上皮層、視錐、視柱細胞層、外界膜、外粒子層、外叢状層、内粒子層、内叢状層、神経節細胞層、神経繊維層、内界膜である。網膜内層は血管膜内面に裏打ちされた薄膜であり、感光作用がある、後部鼻側に視神経乳頭がある。網膜上の感覚層は3つのニューロンからなる。ニューロンは視細胞層であり、錐細胞と幹細胞を含む光を専司する。視柱細胞は主に中心凹所から遠い網膜上にあり、視錐細胞は中心凹所で最も多い。第二層は二節細胞と呼ばれ、約10〜数百個の視細胞が二節細胞を通じて神経節細胞と連絡し、連絡作用を担当している。第三層は節細胞層と呼ばれ、伝導を専門に管理している。網膜は薄いが非常に複雑な構造であり、眼球の後壁部に貼り付けられ、網膜受容器からの衝動を伝達する神経繊維が網膜表面を渡り、視神経を経由して出口に達する。網膜の分解能は不均一で、黄斑域では分解能が強い。それは血管腔面単層扁平上皮様細胞を構成し、それが産生し分泌した生物活性物質は血管張力の維持、血圧の調節、抗血栓形成などに重要な作用があり、網膜血管疾患の発病機序に重要な病理生理学的意義がある。異なる組織と器官から得られる内皮細胞は異なる特性を持つため、脳と網膜の中で、これらの内皮細胞は内障壁の機能を持ち、血管の生理状態を調節し、血管活性物質及び新生血管の形成を放出する中で重要な役割を果たし、体外分離培養RCECは網膜血管性疾患の発生発展の病理生理機序及び疾病の早期予防と治療を研究する上で重要な臨床意義を持っている。
メソッドの概要：

会社の実験室で分離されたヒト網膜微小血管内皮にコラーゲン酵素を採用-中性dan白酵素混合消化法密度勾配遠心分離法を結合し、最後に内皮細胞専用培地培養スクリーニングにより調製した、細胞総量は約5×10？cells/瓶。
品質検査：

会社の実験室で分離されたヒト網膜微小血管内皮経CD 31免疫蛍光鑑定では、純度は90%以上に達することができ、HIV-1、HBV、HCV、マイコプラズマ、細菌、酵母、真菌などを含まない。

パッケージ被条件 PLL（0.1mg/ml），ゼラチン（0.1%）

培地 含むFBS、成長添加剤、ペニシリン、Streptomycin等

液交換周波数 毎2-3日に1回液交換

せいちょうとくせい 壁を張る

細胞形態 内皮細胞様

世代プロパティ 伝達可能2～3世代

しょうかえき 0.25%yiプロテアーゼ

培養条件 気相：空気、95%；CO2の5％

準備作業

1.実験器材の準備：無菌の培養皿、培養瓶、ピペット、遠心管、手術器械などを準備し、高圧滅菌またはその他の適切な消毒処理を行う。

2.試薬の準備：適切な培地、消化酵素（例えば、コラーゲンなど）、ウシ胎児血清、双抗などの試薬を調製または購入し、無菌で有効期間内であることを確保する。

3.実験動物または組織由来の準備：実験ニーズに応じて、適切な動物を選択し、相応の麻酔または処刑を行い、必要な組織を獲得する、または既存の組織サンプルライブラリから組織を取得します。

取材と処理

1.取材：無菌条件下で、迅速に目標組織を取り出し、できるだけ組織への損傷を減らし、そして余分な脂肪、結合組織などの非目的組織を除去する。

2.洗浄：取り出した組織を予冷無菌PBSで数回洗浄し、血液と不純物を除去した。

3.切り取り：組織を約1-2 mm³の小さな塊に切り取り、その後消化する。

細胞分離

1.消化：切った組織塊を適量の消化酵素を含む遠心管に入れ、37℃の恒温ロッカまたは培養箱で一定時間消化する。その間に遠心管を軽く揺らして消化を均一にすることができます。

2.消化停止：組織塊の大部分が単細胞懸濁液または小細胞塊に消化された場合、血清含有培地を添加して消化を停止する。

3.濾過と遠心分離：細胞篩で細胞懸濁液を濾過し、未消化組織破片を除去し、その後濾液を適切な回転速度で遠心分離し、細胞沈殿を収集する。

細胞観察と検出

1.日常観察：毎日倒置顕微鏡で細胞の形態、成長状態、密度などを観察し、細胞の変化状況を記録し、例えば細胞汚染や異常を発見し、直ちに相応の措置をとる。
2.細胞計数と活力検査：必要な場合、台望藍染色などの方法を用いて細胞を計数と活力検査を行い、細胞の成長状況と健康状態を知ることができる。

一、取材と分離

1.迅速な操作

−室温または非栄養環境への長時間曝露を回避するために、組織の取材後すぐに処理する必要がある。

−無菌PBSまたは生理食塩水を用いて組織を洗浄し、血液、不純物を除去する。

2.消化酵素の選択

−組織タイプに応じて消化酵素を選択し、過剰消化による細胞損傷を回避する。

−消化時間は、細胞解離状態を顕微鏡により観察することができる厳格な制御（通常10〜30分）が必要である。

二、培養条件の最適化

1.培地の選択

・血清または特定の成長因子を含む培地（DMEM、RPMI 1640など）を使用して、一部の細胞にインスリン、EGFなどを添加する必要がある。

・培地ブランドまたはバッチの頻繁な交換を回避し、細胞適応圧力を減少させる。

2.壁貼りと継代

・初代細胞の壁貼り能力が弱く、シャーレ（コラーゲン、ポリウレタンなど）を包含する必要がある場合がある。

・継代時密度は70〜80%に制御することが推奨され、過度の合流は接触抑制と分化をもたらす。

三、汚染制御

1.無菌操作

-全過程を超浄台で操作し、交差汚染を回避するために使い捨て消耗品を使用する。

−培地に二重抗を添加することができるが、長期使用は細胞活性に影響を与える可能性がある。

2.マイコプラズマ検出

・定期的にマイコプラズマ汚染（例えばPCR法）を検査し、汚染後直ちに細胞を廃棄する必要がある。

四、状態監視

1.日常観察

・細胞形態、密度及び培地の色を毎日検査し、培地を適時に交換する（通常2〜3日ごとに液交換する）。

-細胞が丸くなり、破片が増えるなどの異常な形態は、汚染や栄養不足を示唆する可能性がある。

2.継代と凍結保存

・初代細胞分裂回数は限られており（一般的に5〜10代）、早期代次細胞を速やかに凍結保存する必要がある。

-凍結保存液はDMSO+血清（または専用凍結保存培地）を使用し、勾配が低下した後に液体窒素を保存することを提案する。