遺伝子編集陽性細胞スクリーニング

交渉可能更新03/04

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製造者の性質: プロデューサー

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オンラインコンサルト

概要

遺伝子編集陽性細胞スクリーニングとは、CRISPR/Cas 9などの遺伝子編集実験の後、目的の遺伝子修飾が成功した細胞を特定の方法で識別し、分離することを指す。一般的なスクリーニング方法としては、抗生物質スクリーニング（例えば、耐性遺伝子マーカーを用いた）、蛍光タンパク質マーカースクリーニング、PCRまたは配列決定検証などが挙げられる。このプロセスは、純粋な結合またはヘテロ結合突然変異細胞系の獲得、遺伝子機能の研究、または疾患モデルの構築にとって重要である。

製品詳細

遺伝子編集陽性細胞スクリーニング：技術戦略と最適化プロセス

陽性細胞スクリーニングは遺伝子編集の核心部分であり、その効率は実験周期と成功率に直接影響する。

一、目標と挑戦を選別する

コアターゲット

編集に成功した細胞（遺伝子ノックアウト/KO、ノックアウト/KIなど）を混合細胞群から分離する。
野生型細胞干渉を排除する（未編集細胞の占有率が高い場合、偽陰性を招きやすい）。

重要な課題

細胞損傷：長期スクリーニングによる細胞老化（豚線維芽細胞の継代後の増殖能力の急激な低下）。
偽陽性リスク：部分編集未wan全破壊遺伝子機能（例えばシフトコード突然変異による機能喪失なし）。
フラックスボトルネック：従来のモノクローナル培養には22日以上かかり、陽性率は20%未満であった。

二、主流の選別技術及び操作プロセス

（一）報告システムに基づく濃縮技術

修復メカニズムを利用して蛍光/耐性マーカー発現をトリガし、可視化と高速選別を実現する：

修復メカニズム	レポートシステム設計	フィルタ方法	優位	ケース
数字	標的破壊蛍光蛋白質終端子→発現回復	FACS選別GFP 8314細胞	直感的で効率的でKOに適している	CRISPR-DIY担体
HDR	相同組換え挿入耐性遺伝子（Puro瘻など）	抗生物質圧力スクリーニング	KIに適合し、低コスト	碧雲天CRISPRプラスミド
SSA	破断誘導単鎖アニーリング修復→蛍光蛋白再構成	フローサイトメトリー	感度が高く、脱ターゲット率が低い	多重遺伝子編集検証

操作の流れ（NHEJ−GFPシステムを例に）：

組み込みの構築GFP−TAA終端子の編集ベクター（sgRNAはTAA領域にターゲット）を含む。

細胞をトランスフェクションした後、NHEJは破壊ターミネーター→GFP発現を修復した。

72 h後使用フローセルメータ（iQueなど）®）GFP 8314細胞を選別する。

（二）微量細胞迅速同定法

画期的なシナリオ：50個の細胞だけで遺伝子型鑑定を完了し、周期を15日以上短縮する。

キーパラメータ：

細胞量：≥50個（20細胞群検出率不足、P<0.01）。
酵素カット感度：T 7 E 1は≧5%の編集効率を検出することができる。
検証手順：Sangerシーケンシングは、挿入/欠落などの突然変異のタイプを確認します。

（三）酵素切断と配列決定検証技術

方法	原理	適用シーン	制限
T 7 E 1酵素カット	ミスマッチ切断による異種二重鎖の発生	初期ふるい（低コスト）	感度が低い（≧5%編集率）
Sangerシーケンシング	ちょくせつよみとりシーケンスへんい	モノクローナル認証	スループットが低い
ハイフラックスシーケンシング	深さ被覆ターゲット部位突然変異	多遺伝子/脱標的分析	成本高

オペレーションの最適化：

ハイブリッドクローンプリフィルタ：FA-PCRは集団編集率を測定し、＞30%の時に単クローンを再選別する。

デュアル認証ポリシー：T 7 E 1初スクリーニング陽性クローン→Sangerシーケンシング確認（偽陽性回避）。

三、技術選択とシーン適合

（一）細胞型による選択

細胞型	推奨方法	理由（りゆう）
プロトセル	微量細胞同定法	長期培養による老化の回避（豚線維芽細胞）
腫瘍細胞系	抗生物質スクリーニング+FACS	増殖が速く、薬剤耐性が安定している
iPSCs の	HDR報告システム+モノクローナルシーケンシング	多能性を維持し、高精度な編集が必要

（二）編集タイプによる選択

タイプの編集	フィルタリング技術	重要な指標
遺伝子ノックアウト（KO）	NHEJ−GFP報告システム	GFP 8314細胞占有率（フロー定量）
遺伝子入力（KI）	抗生物質スクリーニング+PCR検査	耐性生存率+サイドフラップシーケンス増幅
点突然変異（PM）	T 7 E 1+深さシーケンシング	突然変異の頻度＞90%

遺伝子編集陽性細胞スクリーニング

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